Direkt zum Inhalt Direkt zur Hauptnavigation

Konfokalmikroskopie

1957 meldete Marvin Minsky ein Patent an, in dem erstmalig das grundlegende Prinzip der Konfokalmikroskopie beschrieben wird. Aber es dauerte noch weitere 30 Jahre und die Entwicklung des Lasers als Lichtquelle bis die Konfokalmikroskopie zu einer Standard-Mikroskopietechnik wurde. Im Folgenden geben wir einen kurzen Überblick über die Konfokalmikroskopie, wie sie heute in Laboren und industriellen Anwendungen zu finden ist.

Was bedeutet konfokal?

messprinzip eines konfokalmikroskops

Übliche Lichtmikroskope ermöglichen durch eine zweistufige, vergrößernde Abbildung eine Detailbetrachtung eines Objekts. Bei dieser Abbildung weist die Optik des Mikroskops eine endliche Tiefenschärfe auf, ähnlich wie bei der (verkleinernden) Abbildung mit einem Fotoapparat. Das heißt, das Bild des Objekts ist eine Überlagerung aus einer scharfen Abbildung der Punkte in der Fokalebene und einer unscharfen Abbildung von Punkten außerhalb der Fokalebene, die aber von dem Detektor (Auge, Kamerazeile) noch als „scharf“ erkannt werden. Diese Tiefenschärfe verhindert eine Auflösung von Objektdetails in axialer Richtung. Die konfokale Abbildung reduziert diesen Tiefenschärfebereich extrem und ermöglicht auch in axialer Richtung virtuelle optische Schnitte durch das Objekt mit entsprechenden Detailinformationen. Der Trick ist eine Punkt-zu-Punkt-zu-Punkt Abbildung wie in der folgenden Abbildung skizziert.

Das Licht einer punktförmigen Lichtquelle (Lichtquelle plus vorgeschalteter Lochblende) wird optisch in einen Punkt in der Fokusebene des Objektivs auf oder in dem Messobjekt abgebildet. Das von diesem beleuchteten Objektpunkt ausgehende Licht (Fluoreszenzlicht, reflektiertes Licht) wird über die gleiche Optik und einen Strahlteiler auf eine Lochblende vor dem Detektor abgebildet.

Der Detektionsfokus liegt also in der zur Fokalebene des Objektivs konjugierten Ebene, beide Foki liegen also übereinander (= konfokal). Licht, das nicht aus der Fokalebene kommt, wird unterdrückt, weil es nicht auf die Lochblende fokussiert wird, sondern dort als Scheibchen erscheint, so dass es fast komplett geblockt wird.

Dies ist in der Abbildung links durch die gestrichelten Strahlengänge dargestellt für je eine Ebene oberhalb und unterhalb der Fokalebene. Auch Streulicht wird durch diese Lochblende fast komplett geblockt. Das erhöht deutlich den Kontrast und verbessert somit die laterale Auflösung. Mit der konfokalen Abbildung kann die (immer noch beugungsbegrenzte) laterale Auflösung um den Faktor 1,4 größer sein gegenüber der konventionellen Mikroskopie, abhängig von der Größe der Lochblende. Denn es ist zu beachten, dass beugungsbedingt der Lichtpunkt auf der Probe tatsächlich ein Spot von endlicher Größe ist (Airy-Scheibe).

Deshalb muss die Größe der Lochblende auf die Größe dieses Spots optimiert werden. Eine zu kleine Lochblende verringert auch die Menge des nützlichen Lichts, eine zu große Blende lässt zuviel Licht außerhalb der Fokusebene und zuviel Streulicht zu.

Wie entsteht ein Bild des gesamten Objekts?

Da man mit dieser Punkt-zu-Punkt-zu-Punkt Abbildung lediglich Licht von einem Punkt der Probe erhält, ist es notwendig die Probe abzurastern und das Bild am Computer zusammen zu setzen. Es gibt zwei Grundtypen von Konfokalmikroskopen, die sich in der Art der Rasterung in der x-y-Ebene unterscheiden: konfokale Laser-Rastermikroskope und konfokale Mikroskope mit rotierender Scheibe.

Konfokale Laser-Rastermikroskope

Bei dem am häufigsten verwendeten Konfokalmikroskoptyp, dem konfokalen Laser-Rastermikroskop (oder CLSM für confocal laser scanning microscope), wird ein Laser für die Beleuchtung eingesetzt, der in der Fokusebene punktweise das Objekt beleuchtet und dort in jedem Punkt Fluoreszenzmoleküle anregt. Das Fluoreszenzlicht wird auf eine Blende in der Bildebene abgebildet, wobei nur das Licht, das direkt aus der Fokusebene kommt, auch mit einem Photomultiplier oder einer Avalanche-Fotodiode detektiert wird.
Die vollständige Fokusebene wird mit Hilfe eines Rasterkopfs in x- und y- Richtung abgebildet. Dabei wird der Laserstrahl mit einem bewegliches Spiegelsystem über das Objekt geleitet.

Der Laser dient zur Anregung der Fluoreszenz in bestimmten Molekülen. Fluoreszenz bezeichnet den Prozess der Absorption von kurzwelligem (hochenergetischem) Licht und der anschließenden spontanen Emission langwelligeren (niederenergetischen) Lichts. Durch diesen Prozess und mit Hilfe eines dichroitischen Spiegels wird die optische Anregung von der optischen Detektion entkoppelt. Damit ist es z.B. durch den Einsatz verschiedener Fluoreszenzfarbstoffe und Anregungsquellen möglich, an oder in der gleichen Probe unterschiedliche Bereiche zu untersuchen.

Der Durchmesser der Detektor-Blende bestimmt zusammen mit dem Mikroskopobjektiv und dessen numerischer Apertur die Dicke des optischen Schnitts. Dieser liegt im Bereich des 2- bis 2,5-fachen der lateralen Auflösung. Eine dreidimensionale Rekonstruktion des abgebildeten Objektes erhält man durch Aufzeichnung mehrerer Schnitte in verschiedenen Fokusebenen.

Durch die Detektion mit einem Photomultiplier können auch sehr geringe Intensitäten noch detektiert werden.

Das konfokale Bild kann durch den relativ langsamen zeilenweisen Aufbau nur auf dem Bildschirm betrachtet werden. Allerdings wurden die Messrate der konfokalen Laser-Rastermikroskope durch den Einsatz von akusto-optischen Deflektoren und von MEMS-basierten Spiegeln bis auf Video-Raten verbessert.

Die Nutzung der Fluoreszenz bedeutet ein gewisses Maß an Probenpräparation. Daher sind diese Mikroskope weniger gut für die Anwendung in Produktion, Fertigung und Qualitätssicherung geeignet, und finden mehr Einsatz im biologischen und medizinischen Bereich.

Die Bildgröße ist abhängig von der Vergrößerung des Objektivs, lässt sich durch „Stitching“ von mehreren benachbarten Einzelbildern jedoch an die individuellen Bedürfnisse verschiedener Untersuchungen anpassen.

Konfokale Mikroskope mit rotierender Scheibe

Statt eines Lasers kann auch eine breitbandigere Lichtquelle bei den Raster-Mikroskopen eingesetzt werden. Üblicherweise verwendet man aber breitbandigere Lichtquellen, meist LEDs, im Zusammenhang mit einer gleichzeitigen Beleuchtung und Beobachtung mehrerer Punkte auf dem Objekt. Die Lichtpunkte werden hier durch eine rotierende Scheibe mit spiralförmig angeordneten quadratischen oder runden Löchern erzeugt, der Nipkow-Scheibe (Multipinhole-Filter), die aus der Schwarz-Weiß Fernsehtechnik bekannt ist. Die Beleuchtungs-Lochblenden in der Scheibe dienen gleichzeitig auch als Detektor-Lochblenden und blockieren das Licht außerhalb der Fokusebene und Streulicht.

Aufgezeichnet werden die Schnittbilder mit einer CCD Video-Kamera. Diese Art der konfokalen Mikroskopie verwendet keine Fluoreszenz, sondern detektiert das von dem Objekt in der Fokusebene reflektierte Licht. Das ermöglicht auch den Einsatz in Produktion, Fertigung und Qualitätssicherung, wo technische Oberflächen untersucht werden und eine aufwändige Probenpräparation unerwünscht ist.

Durch den schnellen Bildaufbau mit Video-Raten ist zum einen eine direkte Beobachtung möglich, zum anderen können auch sehr schnelle Vorgänge verfolgt werden. Die Vielseitigkeit dieses Messsystems erlaubt die Vermessung von Geometrien und Rauheiten im Bereich von wenigen Mikrometern bis zu einigen Nanometern. Das wird erreicht durch die präzise Verschiebung der Fokalebene mit Piezo-Stellelementen.

Die Bildgröße ist auch hier abhängig von der Vergrößerung des Objektivs, lässt sich durch „Stitching“ von mehreren benachbarten Einzelbildern jedoch an die individuellen Bedürfnisse verschiedener Untersuchungen anpassen.

Bücher

Bücher über dieses Thema finden Sie hier!